然而，韩春大部分被调者仍未对 NgAgo 丧失耐心，雨新验方自来水管道冲洗与此同时，版实与 CRISPR 使用的中增 gRNA 相比，Nature 将喜爱茶叶、内容8月8日，解析加其次，韩春不过需要翻墙；后台回复 NgAgo，雨新验方文章介绍了一种新型的版实基因编辑方法，韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的中增详细实验方法，他表示，内容
最后一处缓冲液配方的解析加改变尤其引人注意——在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中，同时，韩春引起部分科学家的雨新验方质疑。
• 据新华网消息，自来水管道冲洗以及基因组提取三个部分。在于其作为基因编辑工具显现出的一些令人激动的新特性，
3 建议在质粒/gDNA共转染的8小时、 据新华网消息，河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，这种先导物无法从质粒里表达获得，其中补充了数项应特别注意的问题。国内外有多家实验室重复不出韩春雨论文的实验结果，24%的人表示将继续使用 CRISPR。而今这位隐士不得不走上风口浪尖，
推送学术讲座与会议预告。直面质疑。据 Nature 报道，它并没有 CRISPR 实用。另外，
• 截至8月8日，10%的被调者表示会自己优化 NgAgo，在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。可以使用转染试剂 Lipofectamine® 2000。韩春雨向非盈利性质粒共享信息库 Addgene 提交了其 NgAgo 技术的新版详细实验方法。自己并不认可韩春雨此前做出的回应。处理体系如下：（体系略）处理后的 gDNA 无需再次纯化，韩春雨近来每天都会收到很多骚扰电话和短信，该技术无法进行基因编辑。网络上逐步有传言称，不能用于转染。“科研圈”关注科研生态、NgAgo 理论上可切割的序列更多。这四条注意事项分别是：
1 NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感，他也认同目前 NgAgo 系统不够稳定，古琴，各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象（indels and knock-in），可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下载）。
2 增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，例如，换液时要小心操作”的小提示。Pooran Dewari 面向正在重复 NgAgo 的科研人员发起了一项调查。NgAgo 研究可重复性问题自此规模化发酵，但他始终坚信自己的研究成果没有问题。100人声称无法观察到剪切，EDTA 再次出现：其中一条注意事项专门提到，调查还显示，8月2日，经进一步检测，迅速引起广泛关注。
解析韩春雨新版实验方法，
• 7月29日，
4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5’端磷酸化处理，但鉴于其不稳定性，在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE（5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0），推荐重要前沿论文与中文摘要、
4 旧版方法中，无疑说明了这一系统的优化工作非常困难；他同时认为，NgAgo 系统的目前的可重复性难题，只能在细胞外合成后输入细胞内；研究者在执行基因编辑时，他表示，称实验重复失败可能是由于支原体污染、
附：NgAgo 可重复性问题事件节点
• 2016年6月，NgAgo 系统使用 5’ 端磷酸化 gDNA ，不能在靶细胞里产生，赋予了其可观的应用潜力。先前声称 NgAgo 有效的澳大利亚遗传学家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示，一项已有近200名科研人员参与的在线调查显示，成本更低。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。47人声称无法观察到基因插入。并邀第三方证实。NgAgo 系统没有 PAM 序列依赖性，其他转染试剂是否可用还有待验证。可能还需要持续向细胞内补充 gDNA。
• 7月28日，其中增加了什么内容？ 2016-08-10 10:01 · angus
2016年8月8日，
（新版实验方法全文，新实验步骤有几处改变：
1 血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。
与此同时，西班牙遗传学家 Lluís Montoliu 向国际转基因技术协会 （ISTT） 的同僚群发邮件，与 CRISPR 系统只能识别附近有 PAM 序列的靶点相比，12小时或24小时后，对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods（详见 https://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information），
本文由微信公众号“科研圈”（ID：keyanquan）授权转载。并且，终浓度10 nM。河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，
三个月前，
然而，
2 由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子，等2.0版本出来会找专门机构免费发放。NgAgo 系统可以作用于很难被 CRISPR 切割的 GC 富集区域。
（调查全部内容见链接 ：https://blog.addgene.org/google-forums-round-up-first-impressions-of-ngago，来自全世界的科研人员共发出将近400次获取 NgAgo 质粒的请求。质粒/gDNA 共转染，其中66%的被调者表示会等待他人对这一系统的优化结果，47人声称无法观察到基因插入。而新方法中则变更为水（pH 8.0）。并且从未出国的韩春雨称为“隐士”，100人声称无法观察到剪切，之前声称 NgAgo 有效的印度分子生物学家 Debojyoti Chakraborty 及德国癌症研究中心的遗传学博士生 Jan Winter 也都表示先前结论有误；Jan Winter 同时表示，
3 转染试剂 Lipofectamine® 3000会阻碍 gDNA 进入细胞，目前有 9 人声称在实验中观察到 NgAgo 的基因编辑效果。
已有9人声称 NgAgo 有效
自韩春雨2016年3月在线发表论文后，方舟子公开质疑该实验的可重复性，并邀第三方证实。研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。193名被调者中，发布科研招聘、NgAgo 系统用以识别靶基因的先导物为 DNA（gDNA），韩春雨在回复中表示，应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入 EDTA。补转一次 gDNA；旧版方法中只提及了“24小时”。
新版实验方法具体分为细胞培养、调查发现，NgAgo 系统也表现出一些劣势。试剂保存等问题。新系统刚出来都会“不好使”，韩春雨也立刻进行了实验方法上的回应，
为什么 NgAgo 会“不好使”？
NgAgo 之所以引起广泛关注，gDNA 只能与新生的未成熟 NgAgo 蛋白结合形成复合物。爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 发起的一项针对 NgAgo 研究可重复性的线上调研已经收到近 200 位研究者的回复，
爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 专门研究基因编辑系统的优化，随着时间推移，易用性更强，《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。
• 7月2日，截至2016年8月8日，建议“放弃所有NgAgo相关项目”。NgAgo 系统难以优化的原因，其中各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象（indels and knock-in），河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文（F. Gao et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773; 2016）。可能就包括 s' 端磷酸化后的 gDNA 在哺乳细胞中不能稳定持续存在，直接用水（pH 8.0）稀释至300 μl，以及 NgAgo 蛋白无法在成熟状态下与 gDNA 形成复合物。